一般，菌體的形態(tài)有：平板培養(yǎng)菌、穿刺培養(yǎng)菌，甘油保存菌或新鮮菌液等。我們提倡寄送穿刺培養(yǎng)菌或新鮮菌液。 ??平板培養(yǎng)菌運(yùn)送特別不方便，我們收到的一些平板培養(yǎng)菌的培養(yǎng)皿在運(yùn)送過(guò)程中常常已經(jīng)破碎，面目全非，需要用戶重新寄樣。這樣既誤時(shí)間，又浪費(fèi)客戶的樣品。一旦是客戶非常重要的樣品時(shí)，其后果更不可設(shè)想。而甘油保存菌則容易污染。 ??制作穿刺菌時(shí)，可在1.5 ml的Tube管中加入瓊脂培養(yǎng)基，把菌體用牙簽穿刺于瓊脂培養(yǎng)基（固體）中,37℃培養(yǎng)一個(gè)晚上后便可使用。穿刺培養(yǎng)菌在4℃下可保存數(shù)個(gè)月，并且不容易污染，便于運(yùn)送。

(1) 擴(kuò)增產(chǎn)物必須特異性擴(kuò)增，條帶單一。如果擴(kuò)增產(chǎn)物中存在非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，一般難以得到好的測(cè)序結(jié)果。 ??(2) 必須進(jìn)行膠回收純化。 ??(3) DNA純化在1.6~2.0之間，濃度50ng/μl以上。

如果不進(jìn)行膠純化而直接用試劑盒回收，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致測(cè)序出現(xiàn)雙峰甚至亂峰。這主要是非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物或者原來(lái)的PCR產(chǎn)物去除不干凈導(dǎo)致。大多數(shù)所謂的PCR"純化試劑盒"實(shí)際上只是回收產(chǎn)物而不能起到純化的作用。對(duì)于非特異擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)物肯定是無(wú)法去除，而且通常它們不能夠完全去除所有的PCR引物，這會(huì)造成殘留的引物在測(cè)序反應(yīng)過(guò)程中參與反應(yīng)而導(dǎo)致亂峰。

PCR產(chǎn)物首先必須用Agarose膠電泳，將目的條帶切割下，然后純化。使用凝膠回收試劑盒回收。產(chǎn)物用ddH2O溶解。

對(duì)于測(cè)序用質(zhì)粒DNA的一般要求： ??(1) DNA純度高，1.6~2.0之間，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色體DNA，蛋白質(zhì)等。 ??(2) 溶于ddH2O中，溶液不能含雜質(zhì)，如鹽類或EDTA等螯合劑，否則將干擾測(cè)序反應(yīng)的正常進(jìn)行。

我們使用水平瓊脂糖凝膠電泳，并在膠中加入0.5ug/ml的EB，加入一個(gè)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品。電泳結(jié)束后在紫外燈下比較亮度，判斷濃度和純度。此方法可以更直接、準(zhǔn)確地判斷樣品中是否含有染色體DNA、RNA等，也可以鑒別抽提的質(zhì)粒DNA的不同構(gòu)型。 ??質(zhì)粒DNA的3種構(gòu)型是指在抽提質(zhì)粒DNA過(guò)程中，由于各種原因的影響，使得超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒（SC）的一條鏈斷裂，變成開環(huán)狀（OC）分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就變成線狀（L）。這3種分子有不同的遷移率，通常，超螺旋（SC）遷移速度最快，其次是線狀（L）分子，最慢為開環(huán)狀（OC）分子。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，或者用EB-標(biāo)準(zhǔn)濃度DNA比較法只能檢測(cè)抽提到的產(chǎn)物中的濃度，甚至由于抽提的質(zhì)粒DNA中含有RNA、蛋白質(zhì)、染色體DNA等因素的干擾，濃度檢測(cè)的數(shù)值也是沒(méi)有多少意義的。

對(duì)測(cè)序引物的一般要求： ??(1) 特異性與測(cè)序模板結(jié)合，不能有多于4個(gè)堿基以上的錯(cuò)配現(xiàn)象 ??(2) 不能含有混合堿基 ??(3) 長(zhǎng)度17~25堿基 ??(4) 純度高，最好PAGE純化 ??(5) 用ddH2O溶解，不要用TE緩沖液溶解。

測(cè)序引物與待測(cè)樣品DNA分子只能有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是測(cè)序成功的關(guān)鍵。如果測(cè)序引物在DNA模板分子上有不只一個(gè)的結(jié)合位點(diǎn)，將造成測(cè)序反應(yīng)過(guò)程中引物鏈在幾個(gè)結(jié)合位點(diǎn)處同時(shí)擴(kuò)增，反映在測(cè)序峰圖上將出現(xiàn)雙峰或亂峰，無(wú)法讀取序列。

PCR產(chǎn)物測(cè)序出現(xiàn)套峰現(xiàn)象，一般有以下幾種原因： ??(1) PCR用模板不純或PCR用引物特異性不好，擴(kuò)增出的產(chǎn)物除了目的片段外，還有與目的片段長(zhǎng)度相近的片段，即使用凝膠電泳也無(wú)法分離開，這樣的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果是套峰。 ??(2) 結(jié)構(gòu)上的原因，造成了PCR產(chǎn)物測(cè)序出現(xiàn)套峰的現(xiàn)象。PolyA/G/C/T以及原因不明的復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，都會(huì)出現(xiàn)測(cè)序結(jié)果套峰的情況。

在測(cè)序反應(yīng)中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，歸結(jié)其形成原因有以下幾點(diǎn) ??(1) 測(cè)序引物在模板上有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)形成套峰 ??(2) 模板不純，如果是質(zhì)粒或是菌液，原因是非單克隆，如果是PCR,原因?yàn)榉翘禺愋詶l帶 ??(3) 模板序列的特殊結(jié)構(gòu)，如poly結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等 ??(4) 引物降解，引物不純，或引物的特異性不好

這里分四種情況： ??(1) 的確找不到測(cè)序使用的引物序列。目前使用的測(cè)序方法是在ddNTP上做熒光標(biāo)記，測(cè)序儀通過(guò)檢測(cè)ddNTP上的熒光來(lái)讀取序列，因?yàn)橐锉旧硎遣蛔鰺晒鈽?biāo)記的，所測(cè)序列是從引物3' 末端后第一個(gè)堿基開始的，所以在測(cè)序結(jié)果上找不到測(cè)序引物的序列。如果是PCR產(chǎn)物，要想得到PCR引物的序列，可以將PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙鏈測(cè)通或者將PCR產(chǎn)物克隆到載體上，用載體上的引物（注意此引物也不能離插入片段太近）測(cè)序 ??(2) 找不到克隆片段的擴(kuò)增引物。原因可能是您在構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)采用的工具酶的酶切位點(diǎn)距離您的測(cè)序引物太近，由于熒光染料的干擾在序列開始的部分不會(huì)十分準(zhǔn)確 ??(3) 還有一種可能是您的插入片段的插入方向是反的，這時(shí)您不妨找一下您引物的互補(bǔ)序列 ??(4) 存在單引物擴(kuò)增，有一條引物的特異性不好，有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致只有一條引物參與擴(kuò)增

眾所周知，PCR擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)很多錯(cuò)配現(xiàn)象，但不可能所有的錯(cuò)配都發(fā)生在同一位置。PCR片段直接測(cè)序時(shí)，其結(jié)果是PCR片段眾多分子的混合物的結(jié)果。如果在某一個(gè)點(diǎn)上出現(xiàn)了幾十次錯(cuò)配現(xiàn)象，但大多數(shù)分子（或許是幾十萬(wàn)個(gè)分子）在這個(gè)點(diǎn)上應(yīng)該還是正確的，在測(cè)序時(shí)，錯(cuò)配現(xiàn)象也就反映不出來(lái)了。因此，PCR片段直接測(cè)序的結(jié)果反映的是PCR用模板最原始的結(jié)果。而PCR片段經(jīng)克隆后測(cè)序是測(cè)定了某一個(gè)分子的DNA序列。在幾十個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增過(guò)程中，很難保證某一個(gè)分子的任何點(diǎn)都不發(fā)生錯(cuò)配。因此，PCR片段經(jīng)克隆后的測(cè)序結(jié)果，往往存在著一些錯(cuò)配的序列，和PCR片段直接測(cè)序的結(jié)果相比有些堿基會(huì)有所不同。這種錯(cuò)配現(xiàn)象的多少取決于PCR擴(kuò)增時(shí)使用的DNA聚合酶的保真性能。要減少PCR擴(kuò)增過(guò)程中的錯(cuò)配現(xiàn)象，在PCR反應(yīng)時(shí)，請(qǐng)選用保真性能高的DNA聚合酶。

一段基因序列經(jīng)擴(kuò)增后，克隆到載體中進(jìn)行測(cè)序。在兩個(gè)層次上可能導(dǎo)致序列發(fā)生變化。首先，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中就可能產(chǎn)生錯(cuò)誤，將片段克隆到載體中也有可能發(fā)生突變；其次，測(cè)序的準(zhǔn)確率問(wèn)題。 ABI公司承諾其儀器的測(cè)序精度在一定范圍內(nèi)可以達(dá)到98.5%以上。由于儀器準(zhǔn)確率的限制，在一個(gè)較長(zhǎng)的序列中發(fā)生堿基序列錯(cuò)誤是難以避免的。在確認(rèn)克隆無(wú)誤的情況下，通過(guò)雙向測(cè)序可以最大限度減少測(cè)序的錯(cuò)誤。您如果想得到您的最準(zhǔn)確的序列，進(jìn)行雙向測(cè)序是很有必要的。只進(jìn)行簡(jiǎn)單的單向測(cè)序，我們無(wú)法保證所測(cè)序列的完全準(zhǔn)確性，這是由儀器的精度決定的。

客戶需要將測(cè)序樣品或引物（客戶自帶的）返還時(shí)，我們?cè)诎l(fā)送測(cè)序報(bào)告的同時(shí)，按客戶要求寄回樣品或引物（客戶自帶的)。 ??2）對(duì)于沒(méi)返回的測(cè)序樣品和引物，公司負(fù)責(zé)保存二個(gè)月（從樣品收到之日算起)，超過(guò)二個(gè)月還需測(cè)序的樣品，請(qǐng)客戶另行提供。

測(cè)序用引物要求非常嚴(yán)格，不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板結(jié)合，3' 端的幾個(gè)堿基能完全配對(duì)，即使引物長(zhǎng)達(dá)80~100多個(gè)堿基，只要調(diào)整PCR反應(yīng)條件，也能成功進(jìn)行PCR反應(yīng)。 ??而測(cè)序用引物便不一樣了，必須嚴(yán)格符合以下要求。本公司的測(cè)序用引物全用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo設(shè)計(jì)。在本公司測(cè)序時(shí)，我們可免費(fèi)幫助設(shè)計(jì)測(cè)序用引物。 ??●長(zhǎng)度在15~25個(gè)堿基左右，一般選擇20個(gè)堿基（根據(jù)GC含量作適當(dāng)調(diào)整)，3' 端盡量選擇G或C堿基（但不絕對(duì)），以增加與模板的結(jié)合能力。 ??●Tm溫度應(yīng)選擇50℃~70℃左右。 ??●GC含量應(yīng)選擇在50%左右，盡量避開A、T、G、C的連續(xù)結(jié)構(gòu)。 ??●避開引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物二聚體結(jié)構(gòu)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)。 ??●保證引物和模板100%匹配，特別是3'端的幾個(gè)堿基一定要100%匹配。同時(shí)必須嚴(yán)格保證引物和模板之間只能有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

在檢查報(bào)告時(shí)，設(shè)備和我們的技術(shù)員都傾向于提供給客戶一個(gè)單一的信號(hào)，所以在出現(xiàn)雜合的位置上給出的信號(hào)往往是比較強(qiáng)的一個(gè)信號(hào)。所以如果您的PCR樣品上是存在雜合位點(diǎn)的，請(qǐng)?jiān)跍y(cè)序訂單上注明，我們?cè)谛薷膱?bào)告時(shí)會(huì)加以注意。但如果在您預(yù)期出現(xiàn)雜合信號(hào)的位置上只有單一的信號(hào)，那么我們是不會(huì)人為將其修改為雜合位點(diǎn)的。出現(xiàn)這樣的情況可能是在您的樣品中雜合成份太少的信號(hào)強(qiáng)度不足以被檢查到，也許有其他更加靈敏的檢測(cè)手段可以滿足您的要求。

超過(guò)6Kb的DNA片斷用Shot Gun 進(jìn)行測(cè)序準(zhǔn)確并且節(jié)省時(shí)間， Shot Gun方法如下： ??(1) 用物理方法打碎DNA ??(2) 回收1~1.5K的片斷 ??(3) 用核酸酶切平端，連接入載體 ??(4) 按照一定比例進(jìn)行測(cè)序，保證每一個(gè)區(qū)段有3倍以上的數(shù)據(jù) ??(5) 編輯所有測(cè)序數(shù)據(jù) ??(6) 如果有缺少數(shù)據(jù)的區(qū)域，還需要補(bǔ)充測(cè)序，拼接成完整序列

ABI3730測(cè)序儀是采用AB公司配套的Big DYE Terminator cycle sequencing Kit，其準(zhǔn)確性達(dá)到800堿基只有1個(gè)以下的錯(cuò)誤，并且該測(cè)序儀對(duì)堿基的判讀有一個(gè)自身的評(píng)判值（Quality Value），根據(jù)QV值的大小，也可以幫助我們來(lái)判斷每一個(gè)堿基的準(zhǔn)確程度

有的客戶想用測(cè)序的方法檢測(cè)點(diǎn)突變體，我認(rèn)為該方法可靠性不高。主要有以下兩個(gè)原因。首先，我們并不清楚突變的序列與正常的序列的比例是多少。測(cè)序反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度直接與模板的量有關(guān)，如果突變的模板所占的比例很少，將直接作為背景噪音了，很難檢測(cè)出來(lái)。只有當(dāng)測(cè)序反應(yīng)體系中正常的和突變的模板量比較接近時(shí)，才能較可靠地檢測(cè)到突變體的存在。其次，在同一位置，不同堿基的信號(hào)強(qiáng)度一般是不一樣的。這樣即使突變的模板所占的比較較高時(shí)，也不一定能準(zhǔn)確檢測(cè)到突變的存在。 ??另外，測(cè)序儀是設(shè)計(jì)用來(lái)測(cè)序正常的堿基序列的，軟件在對(duì)掃描的結(jié)果進(jìn)行處理時(shí)，會(huì)盡量提高主峰而將背景信號(hào)盡量壓低，以得到盡可能好的結(jié)果。因此，當(dāng)某處出現(xiàn)雙峰時(shí)，測(cè)序儀一般會(huì)認(rèn)為信號(hào)弱的峰為背景信號(hào)，在處理過(guò)程中，將弱的峰進(jìn)一步壓低，這樣不利于突變體的檢測(cè)。因此認(rèn)為，用測(cè)序的方法檢測(cè)突變體的存在不是一個(gè)好的方法。