1.從文庫構(gòu)建來說： （1） 文庫構(gòu)建方式靈活：根據(jù)樣本的類型，提供的樣本量等方面考慮，可采用smart，geteway，infusion體外重組和T4體外連接等方式進行文庫構(gòu)建； （2） 文庫片段大小可控：根據(jù)客戶想要研究的蛋白類型大小控制片段的大小，以提高篩選到目標(biāo)蛋白的可能性。如白細胞介素，生長因子類的小分子蛋白；轉(zhuǎn)錄因子，信號通路類的分子量稍大一些的蛋白； （3） 單雙雜文庫通用：構(gòu)建一種類型的文庫，可同時用于單雙雜篩選； 2.對于文庫篩選來說： （1）篩庫方式多樣：可采用mating或共轉(zhuǎn)的方式進行文庫篩選； （2）互作強弱可控化：提高（降低）篩選壓力，用于篩選出強（弱）相互作用的蛋白。 （3）陽性結(jié)果進一步驗證：文庫篩選出的陽性結(jié)果，可進行點對點驗證進一步排除假陽性。

主要業(yè)務(wù)范圍如下： 1.核酵母單/雙雜文庫構(gòu)建； 2.膜酵母雙雜交文庫構(gòu)建； 3.核酵母單/雙雜文庫篩選； 4.膜酵母雙雜交文庫； 5.核酵母單/雙雜點對點驗證； 6.膜酵母雙雜交點對點驗證。

（1）HIS3。Y2HGold不能合成組氨酸，因此不能在缺乏這種必需氨基酸的培養(yǎng)基上生長。當(dāng)誘餌和獵物蛋白質(zhì)相互作用時，Gal4-responsive His3的表達允許細胞生物合成組氨酸并在其最小的培養(yǎng)基上生長.可添加3’AT進行背景抑制。 （2）ADE2。Y2HGold也不能在不含腺嘌呤的最小培養(yǎng)基上生長。然而，當(dāng)兩種蛋白質(zhì)相互作用時，Ade2表達被激活，使這些細胞在Ade最小培養(yǎng)基上生長。 （3）MEL1。MEL-1編碼-半乳糖苷酶，一種在許多酵母菌中自然存在的酶。由于雙雜交相互作用，?α-galactosidase (MEL1)由酵母細胞表達和分泌。表達Mel1的酵母菌落在致變色底物X-α-Gal存在下變成藍色。 （4）AUR1-C，AUR1基因的一個顯性突變版本，編碼肌醇磷酸化神經(jīng)酰胺syn- thase酶。AUR1-C在Y2HGold酵母株中表達，是由于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，使GAL4轉(zhuǎn)錄激活和DNA結(jié)合域接近。可以添加ABA進行背景抑制。, PABAI載體攜帶Ura3基因，PGADT7載體攜帶Leu基因，PGBKT7載體攜帶trp基因, 篩選所用到的平板：一缺：SD/- Ura， SD/- Leu /+AbA ； 二缺：DDO[SD/-Leu/-Trp]， DDO/X[SD/-Leu/-Trp/X-α-gal] ； 三缺：TDO [SD/-Leu/-Trp/HIS3]； 四缺：QDO[SD/-Leu/-Trp/-HIS3/-ADE2]

（1）PGBKT7載體用于構(gòu)建核酵母雙雜Bait-PGBKT7質(zhì)粒或作空白對照。 （2）PGADT7載體用于構(gòu)建核酵母雙雜，單雜Prey-PGADT7質(zhì)粒或作空白對照。 （3）PABAI 載體用于構(gòu)建單雜Bait-PABAI質(zhì)粒。 （4）PGBKT7-53質(zhì)粒與PGADT7-T質(zhì)粒作為核酵母雙雜驗證和篩選的陽性對照組。 （5）PGBKT7-lam質(zhì)粒與PGADT7-T質(zhì)粒作為核酵母雙雜驗證和篩選的陰性對照組 （6）pOST1-NubI 質(zhì)粒與pBT3-N-bait質(zhì)粒作為膜酵母雙雜交驗證和篩選的功能驗證對照組； （7）pBT3-N載體用于構(gòu)建N端位于胞質(zhì)，C端位于細胞器腔內(nèi)（或者胞外）誘餌蛋白； （8）pBT3-SUC載體用于構(gòu)建N端位于細胞器腔內(nèi)（或者胞外），且N端含有信號肽的誘餌蛋白； （9）pBT3-STE載體用于構(gòu)建C端位于胞質(zhì)，N端位于細胞器腔內(nèi)（或者胞外），且N端不含信號肽的誘餌蛋白； （10）pBT3-N和pBT3-STE皆可N端C端均位于胞質(zhì)的誘餌蛋白； （11）pPR3-C載體用于C端位于胞質(zhì)，N端位于胞外或細胞器腔的獵物蛋白構(gòu)建； （12）PPR3-N載體用于膜文庫構(gòu)建和不跨膜的獵物蛋白構(gòu)建； （13）Ptsu2-APP質(zhì)粒和pNubG-Fe65質(zhì)粒作為膜酵母雙雜驗證和篩選的陽性對照組； （14）Ptsu2-APP質(zhì)粒和PPR3-N質(zhì)粒作為膜酵母雙雜驗證和篩選的陰性對照組 （15）Y187菌株：Clontech公司開發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母單雜，雙雜實驗用菌株，MATα型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒或與MATa型酵母菌株（Y2HGold，AH109等）通過mating操作進行篩庫試驗。缺陷 trp1, leu2，報告基因為：lacZ, MEL1。 （16）Y1HGOLD菌株：Clontech公司開發(fā)的GAL4-AbA酵母單雜系統(tǒng)用菌株，MATα型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進行篩庫試驗。缺陷 ura3，leu2；報告基因為：AbAr。 （17）Y2HGold菌株：Clontech公司開發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實驗用菌株，MATa型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒或與MATα型酵母菌株Y187通過mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation? marker為: trp1, leu2，報告基因為：AbAr, HIS3, ADE2, MEL1。 （18）NMY51菌株:DUALsystems BioTech公司開發(fā)的檢測膜蛋白間相互作用的酵母雙雜實驗用菌株，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進行蛋白互作驗證或篩庫試驗；此菌株缺陷 trp1, leu2-3，報告基因為：HIS3, ADE2 和 lacZ

建庫：總RNA提取——mRNA分離及純化——雙鏈cDNA合成及純化——雙鏈cDNA與PGADT7載體體外連接——大腸文庫菌液——文庫質(zhì)粒——轉(zhuǎn)化Y187酵母宿主——Y187酵母文庫菌液 雙雜篩選：（1）matting方式：誘餌重組質(zhì)粒PGBKT7載體構(gòu)建——誘餌重組質(zhì)粒和PGADT7空載轉(zhuǎn)Y2Hgold酵母宿主進行自激活驗證——含誘餌的Y2Hgold酵母菌液與Y187酵母文庫菌液進行混合——根據(jù)自激活結(jié)果涂布篩選平板——陽性結(jié)果點鐘——陽性菌培養(yǎng)提質(zhì)粒——PCR陽性鑒定——送測——測序結(jié)果分析 （2）共轉(zhuǎn)：誘餌重組質(zhì)粒PGBKT7載體構(gòu)建——誘餌重組質(zhì)粒和PGADT7空載轉(zhuǎn)Y2Hgold酵母宿主進行自激活驗證——文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含誘餌的Y2Hgold酵母感受態(tài)——根據(jù)自激活結(jié)果涂布篩選平板——陽性結(jié)果點鐘——陽性菌培養(yǎng)提質(zhì)粒——PCR陽性鑒定——送測——測序結(jié)果分析 單雜篩選：誘餌重組質(zhì)粒PABAI載體構(gòu)建——線性化誘餌重組質(zhì)粒和PGADT7空載轉(zhuǎn)化Y1Hgold酵母宿主進行自激活驗證——文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含誘餌的Y1Hgold酵母感受態(tài)——根據(jù)自激活結(jié)果涂布篩選平板——陽性結(jié)果點鐘——陽性菌培養(yǎng)提質(zhì)粒——PCR陽性鑒定——送測——測序結(jié)果分析

可以通過啟動子序列分析查找，確定探針設(shè)計范圍，如果范圍太寬泛，可以先將0.5-1kb片段克隆到熒光素酶報告載體驗證其啟動子活性以及是否受到該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控；尋找核心啟動子可以通過分段截斷驗證。如果研究的轉(zhuǎn)錄因子具有已知的結(jié)合序列motif，則可以在該motif位點選擇探針。也可以先進行ChIP或DNA pull down找到富集序列之后，再設(shè)計分段探針進行驗證。

a.啟動子結(jié)構(gòu)分析，將啟動子區(qū)域序列（通常2k左右）進行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c進行突變，再分別構(gòu)建入luciferase報告載體，檢測其啟動子活性。
b.啟動子SNP分析，一些基因的啟動子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性，可運用熒光素酶報告系統(tǒng)分析其相對活性。
c.驗證特定轉(zhuǎn)錄因子同其調(diào)控序列的作用，將該序列（通常為啟動子區(qū)域）插入報告基因載體，同時在實驗細胞中共轉(zhuǎn)過表達該轉(zhuǎn)錄因子，可分析轉(zhuǎn)錄因子過表達是否提高熒光素酶活性。
d.可以分析信號通路是否激活，將該信號通路的下游響應(yīng)原件序列構(gòu)建入報告基因載體，在不同上游信號條件下，熒光素酶活性代表了通路的下游響應(yīng)。例如在GPCR研究中，將cAMP response element（CRE）載入報告基因載體，構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞株后，可以用于分析GPRC的激活與抑制劑篩選。又如，將HIF1α的響應(yīng)原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase報告載體構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，可以用于低氧相關(guān)通路的研究。
e.驗證microRNA的靶序列，將待測的3’UTR序列插入報告基因載體，再共轉(zhuǎn)入該microRNA，如果熒光素酶活性下降，則提示為其靶序列。

Luciferase的靈敏度相比于GFP提高10-100倍以上，同時具有更寬的動態(tài)范圍，便于數(shù)值分析比較，不需要熒光顯微鏡，而且在活體實驗中其熒光穿透性高于EGFP等熒光蛋白，同時由于沒有內(nèi)源活性、其本底信號很低。 而GFP等熒光蛋白相比于熒光素酶的優(yōu)勢在于可以進行失蹤定位，并且其觀測不需裂解細胞，方便進行適時觀察。

海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶相比，相對活性如何？ 在氧、鎂和ATP的存在下，螢火蟲熒光素酶作用于螢火蟲熒光素，而來源于海洋腔腸（Renilla reniformis)的熒光素酶在氧的存在下作用于海腎熒光素。雙報告基因技術(shù)（Dual-reporter assays）,結(jié)合了螢火蟲熒光素酶測試和海腎熒光素酶測試。

轉(zhuǎn)染效率低的話可以從三個方面改善，首先要確保細胞狀態(tài)是好的，通常我們選出處于分裂期的細胞，另外陽性對照您可以選擇過表達的熒光蛋白質(zhì)粒，還有就是DNA的質(zhì)量尤為重要，最好是先酶切驗證。 這個實驗檢測結(jié)果很靈敏，有一定差異是正常的，通常只要確保它在一個數(shù)量級之內(nèi)即可。如果差異超出這個范圍可以從兩方面改善，一是記住保持樣本的均一性，二是加樣要準(zhǔn)確。

凝膠遷移或電泳遷移率檢測（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一種檢測蛋白質(zhì)和DNA序列相互結(jié)合的技術(shù)，可用于定性和定量分析；目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，是轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。 金開瑞提供EMSA檢測技術(shù)服務(wù)，幫助您檢測DNA結(jié)合蛋白、RNA結(jié)合蛋白、特定的蛋白質(zhì)，并可進行未知蛋白的鑒定。

當(dāng)客戶用組織或細胞核蛋白進行實驗時，無法確定與探針結(jié)合的具體蛋白，需要再提供要研究的抗體，再進行supershift實驗。如果抗體能識別與探針結(jié)合的蛋白，則會出現(xiàn)一條超遷移條帶，即可證明探針與蛋白的結(jié)合。需客戶提供IP級別的抗體。

使用天然組織細胞樣本進行實驗，通過抽提核蛋白獲取目的蛋白，此為混合蛋白，如要確定某個蛋白結(jié)合于探針時，需要加入抗體觀察是否形成超遷移條帶。可以通過重組蛋白表達系統(tǒng)（如金開瑞的大腸、酵母、哺乳、無細胞等）獲得特定的重組蛋白，后續(xù)實驗中如出現(xiàn)遷移條帶，則應(yīng)源于該蛋白的結(jié)合作用。

除了探針序列具有理論預(yù)測性、本身屬于探索性實驗的情況之外，組織細胞中該轉(zhuǎn)錄因子豐度較低、只在特定條件階段表達，特定蛋白同DNA結(jié)合需要一定的離子或輔助因子條件（如Mg2+、Zn2+、ATP），重組表達蛋白在DNA結(jié)合活性方面同天然蛋白存在差異，結(jié)合力較弱，需要其他蛋白間接作用于DNA等情況下，都難以獲得遷移條帶。此外，當(dāng)研究的蛋白本身pI較大（如大于8.0），蛋白在native電泳中將難以隨同DNA一起向陽極泳動，或在電泳最初階段同DNA解離開。

免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原抗體特異性反應(yīng)純化富集樣品中目的蛋白的一種方法。通常使目標(biāo)蛋白同抗體-protein A/G形成免疫復(fù)合物沉淀而得以收集，然后通過WB檢測目的蛋白。 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）是將樣品中同抗體靶蛋白相互作用的蛋白一同隨免疫復(fù)合物沉淀，可以檢測兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)存在相互作用，也可以確定一種蛋白在體內(nèi)的相互作用蛋白。

coIP實驗需要保證足夠的蛋白濃度才能維持原本存在的蛋白互作狀態(tài)，尤其當(dāng)?shù)鞍棕S度較低、相互作用力不強、使用不易提蛋白組織等情況時。而且coIP的實驗條件往往需要反復(fù)摸索。因此用于coIP實驗需準(zhǔn)備細胞＞2x10^7，動物組織＞500mg，植物組織＞2g，并且須更加注意采集后速凍-80℃保存和避免反復(fù)凍融。

a.所使用的抗體不僅需要優(yōu)秀的親和力、特異性，其識別表位還可能被互作蛋白所掩蔽（主要是使用單抗時）； b.當(dāng)?shù)鞍谆プ黜毎l(fā)生在特定生理代謝條件、組織細胞類型之中時，coIP實驗可能無法獲得互作結(jié)果； c.如果誘餌蛋白和或捕獲蛋白在樣本中豐度很低時； d.兩個互作蛋白的親和力較弱； e.當(dāng)該蛋白互作需要較特定的離子強度，或者需要如Ca離子/Mg離子/ATP等輔因子時，要創(chuàng)造合適的反應(yīng)條件會變得困難； f.一些樣品處理提取存在難度，提取足量目的蛋白與保持蛋白天然狀態(tài)，需通過實驗條件達到優(yōu)化平衡； g.外源表達的標(biāo)簽蛋白存在同內(nèi)源蛋白的位點競爭，這主要在使用標(biāo)簽抗體進行實驗時可能存在。

在coIP-WB鑒定結(jié)果中，IgG組無目的蛋白條帶、IP組有目的蛋白條帶，說明IP過程成功；銀染膠圖中，IP組相對于IgG組有更多蛋白條帶、且存在差異，說明coIP過程捕獲到互作蛋白；IP產(chǎn)物在質(zhì)譜檢測中鑒定到的蛋白數(shù)量不能作為判斷實驗成敗的標(biāo)準(zhǔn)，因為這取決于目的蛋白本身所具有的互作蛋白數(shù)量、結(jié)合力強弱等方面；IP產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定數(shù)量越多并不代表結(jié)果越好。

coIP所獲取的樣品，可以借助特異性抗體進行WB驗證某種特定蛋白的存在（即認為互作蛋白），也可進行蛋白質(zhì)譜鑒定找出互作蛋白，尤其當(dāng)尋找未知互作蛋白時更需通過質(zhì)譜分析。 直接用細胞組織內(nèi)源蛋白進行實驗發(fā)現(xiàn)的互作蛋白可能是通過其他蛋白形成復(fù)合物，當(dāng)pull-down體系中僅有兩個重組蛋白、仍然能存在互作時，說明這兩個蛋白是直接互作而不是通過其他蛋白形成多聚復(fù)合物。 將蛋白進行分段階段表達之后進行pull-down，可以分析發(fā)生互作的結(jié)構(gòu)域；將蛋白進行突變后表達，可以分析互作發(fā)生的關(guān)鍵氨基酸位點。