CUT&TAG
- 耗時短
- 信噪比高
- 高空間分辨率
- 高靈敏度
- 低樣本需求
服務特色
結合了ChIP-seq的優點和基于Tn5轉座酶的tagmentation?法，能夠快速、?效地鑒定染?質上蛋?質的結合位點。相較于傳統的ChIP-seq技術，Cut&Tag具有更快的實驗速度、更?的分辨率和更低的細胞輸?要求。
服務介紹
CUT&Tag（CleavageUnderTargetsandTagmentation)，即靶向剪切及轉座酶技術，是?種利?酶錨定技術進行高效、?分辨率的DNA測序?庫構建方法，也是替換傳統的ChIP-Seq?以研究蛋白質-基因組互作關系研究的新?法，屬于新?代超微量ChIPSeq技術。可用于檢測組蛋白、RNApolymeraseII和轉錄因?等具有DNA結合功能的蛋白種類，對表觀遺傳學、腫瘤和干細胞等領域的研究具有重要意義。
CUT&Tag（Cleavage Under Target & Tagmentation）技術是一種研究蛋白質-DNA互作的新方法，它與ChIP-seq研究目的相同，在建庫細胞量、信噪比、樣本重復性等都有優勢。
CUT&Tag 方法中用到了預裝接頭 DNA 并與蛋白 A/G 融合的超高活性 Tn5 轉座酶。這種融合蛋白能與一抗結合，在抗體附近切割 DNA，并插入帶有接頭序列的短標簽。回收標簽化的 DNA 片段后，使用引物識別添加的標簽中的序列進行 PCR 擴增，以生成測序文庫。
原理簡介：
在抗體引導下，ChiTag酶僅在目的組蛋白修飾標志、轉錄因子、染色質調控蛋白結合染色質的局部進行目的 DNA的?段化的同時添加測序接頭，并釋放到細胞外，而絕?部分無關的染色質還留在細胞核內，因而整個實驗的信噪比大幅提?，同時簡化了實驗步驟。該方法可?管式?通量應?，并可與單細胞測序平臺「?縫」結合。ChiTag酶在打斷基因組的同時加上接頭，不需要繁瑣的補平加 A加接頭，在?天內可以完成從細胞到測序?庫制備全流程。
服務優勢
- 低樣本需求：細胞起始量較低(單細胞 5*10^5 )，從百萬級降低到單細胞?平；
- 高重復性：CUT&Tag方法具有較高的重復性，可在相同樣本中得到一致的結果；
- 高信噪比：相比傳統的染色質免疫沉淀（ChIP）方法，CUT&Tag方法信噪比較高，減少非特異性結合和背景噪音；
- 流程簡便：無需甲醛交聯、細胞破碎和超聲片段化DNA等步驟，簡化實驗操作流程；
- 簡化的文庫構建：通過添加“接頭”到轉座子上，只需進行簡單的PCR擴增即可獲得高質量的NGS文庫；
- 較低的測序深度：相較于ChIP方法，CUT&Tag方法在保持高質量結果的同時，測序深度減少10倍左右，節省測序成本。
服務流程
客戶提供
1、細胞量：離心后肉眼可見明顯細胞量（約10^6）即可進行CUT&TAG，足量細胞加凍存液后用凍存管裝，干冰寄送，若要做WB 驗證，細胞量需多一倍。
2、抗體需為ChIP級別抗體：抗體≥30ul抗體/次（分裝管需要提供抗體說明書或品牌貨號）
3、我司提供ChIP級標簽抗體種類及價格請私聊確認
最終交付
- 結題報告以及全部原始數據。
- 測序數據質量評估：過濾掉低質量數據，保證數據質量
- 與參考基因組比對：reads分布及比對結果可視化
- peak峰calling：分析蛋白結合位點
- motif分析：蛋白結合序列的偏好性
- peak峰相關基因注釋：尋找蛋白潛在調控基因
- 差異peak分析：分析不同樣本間差異peak峰
- 相關基因功能分析：相關基因GO, KEGG富集分析
服務說明
案例分析
1、Yy1保護與擴展多能性相關的多維表觀遺傳景觀
具有形成胚胎和胚胎外譜系的潛?的胚胎?細胞（ESCs）稱為擴展多能?細胞（EPSCs）。2022年研究?員運?CUT&TAG、ATAC-seq、Hi-C等技術探究EPSC多維度表觀調控機制。結果表明，轉錄因?Yy1與EPSC中特定的開放染?質區域結合。Yy1缺失導致DNA低甲基化，并通過促進CCCTC結合因?(CTCF)介導的圍繞其基因座的EP相互作?的形成，上調Kdm5c和Hdac6的表達，從?顯著降低H3K4me3和H3K27ac在EPSC特異性基因啟動?上的富集。
?獻：
Xiaotao Dong and others, YY1 safeguard multidimensional epigenetic landscape associated with extended pluripotency, Nucleic Acids Research, Volume 50, Issue 21, 28 November 2022, Pages 12019–12038, https://doi.org/10.1093/nar/gkac230
2、表觀遺傳閱讀器SP140功能喪失導致克羅恩病
斑點蛋?140(SP140)是?種免疫受限的植物同源結構域和含有溴化域的表觀遺傳“閱讀器”，SP140功能缺失突變與克羅恩病相關。在2022年?項研究中，證明了SP140的存在會抑制健康細胞中的拓撲異構酶活性從?減少TOP與染?質的結合。?SP140的缺失導致TOP活性釋放，最終導致了巨噬細胞基因表達和對細菌的殺傷作?缺陷，從?造成了腸道的異常。?
章還強調了突變位點可能是潛在治療靶點。
?獻：
Amatullah H, Fraschilla I, Digumarthi S, et al. Epigenetic reader SP140 loss of
function drives Crohn's disease due to uncontrolled macrophage topoisomerases.Cell.2022;185(17):3232-3247.e18.doi:10.1016/j.cell.2022.06.048
常見問題與解析 (Q&A)
適用于常規哺乳動物細胞的蛋白質-DNA互作研究，酵母、植物等細胞可以經過特殊的處理(破除細胞壁或者提取細胞核)來進行實驗。分析的時候應該保證該物種有參考基因組，且注釋完整，如果需要聯合分析，應保證組學基因組和樣本命名一致。而細菌樣本不適合做CUT&Tag，因為有一層細胞壁，不能直接與Con A beads結合，且細菌沒有完整的核結構，因此無法開展此項實驗。
CUT&Tag能在異染色質區域檢測到組蛋白修飾和結合蛋白，常用于研究異染色質相關的組蛋白修飾，如H3K27me3和H3K9me3。除此之外，它對低豐度轉錄因子的檢測效果優于ChIP-seq，所需細胞量更少，即使這些因子在基因組中的結合位點較少也能精確識別轉錄因子的結合位點。
相關技術服務
| ? 酵母單雜交 | ? EMSA | ? DNA pull-down |
| ? GST pull-down | ? CO-IP | ? ChIP-qPCR |
| ? RNA pull-down | ? RIP-qPCR | ? 酵母雙雜交 |
| ? 雙熒光素酶報告系統 | ||
相關資源
1、CUT&Tag與ChIP-Seq區別比較
|
CUT&Tag |
ChlP-Seq |
|
1、細胞滲透性處理 |
1、甲醛交聯處理細胞 |
|
2、一抗進入細胞，與目的蛋白結合，二抗進入細胞，與一抗結合 |
2、細胞破碎，收集裂解液 |
| 3、pA-Tn5轉座體進入細胞，與抗體結合 | 3、超聲打斷基因組DNA |
|
4、加入Mg2+激活轉座體，片段化目的蛋白局部DNA |
4、加入一抗和Protein A磁珠，進行免疫沉淀 |
|
5、提取DNA, PCR,文庫構建完成 |
5、洗脫，解交聯 |
| 6、高通量測序 | 6、DNA補平，加A，加接頭 |
| 7、PCR，文庫構建完成 | |
|
8、高通量測序 |
|
參數 |
ChIP-Seq | CUT&Tag |
|
甲醛交聯 |
是 | 否 |
|
超聲破碎 |
是 | 否 |
|
方法獲取片段化DNA方法 |
超聲打斷 | 使用Tn5轉座酶 |
|
細胞起始量 |
10-10^7 | 單細胞 5*10^5 |
| 測序深度 | 20-50M reads | 3-5 M reads（低豐度靶點可嘗試增加） |
| 是否需要完整的建庫流程 | 需要 |
不需要 |
|
(T5可直接在DNA片段兩喘加測序接頭，一次PCR增即可) |
||
|
完成時間 |
≤1周 | 1-2天 |
|
二抗 |
常規不使用 | 使用 |
|
細胞核提取 |
需要 | 非必須 |
ChIP-Seq的劣勢：?先，ChIP需要較多的細胞量，免疫共沉淀需要?夠的靶標蛋?，?靶標蛋?有限的情況下就需要提供?量的細胞；其次，信噪?低，很多轉錄因?和染?體的結合相對松散，需要甲醛強交聯，以防?后續洗滌過程破壞這些結合，這樣導致很多?特異性信號，需要更?的數據量得到真實peak值；此外，實驗的打斷條件、重復性差等都需要系統的摸索才能得到較好的結果。這些因素綜合起來導致ChIP對新??常不友好，需要采購特定的設備、很?時間的預實驗才能得到滿意的結果。CUT&Tag技術，它免去了甲醛交聯、超聲破碎和免疫共沉淀的過程，這樣既節省了初始實驗材料?提?了信噪?、提升了實驗可重復性。
2、為獲得更全面的信息，CUT&Tag方法常與哪些技術聯用？
● RNA-seq：將CUT&Tag與RNA-seq技術聯用可以同時研究DNA結合蛋白與基因表達之間的關系。通過結合CUT&Tag獲得的DNA結合蛋白的結合位點信息和RNA-seq分析的轉錄組數據，可以揭示特定DNA結合蛋白在基因調控中的作用，識別靶基因以及相關的調控網絡。
● 蛋白質質譜（Proteomics）：CUT&Tag方法可以與蛋白質質譜技術聯用，以鑒定和定量與DNA結合蛋白相互作用的蛋白質。通過將CUT&Tag中所使用的特定抗體用于免疫沉淀，然后將沉淀的蛋白質進行質譜分析，可以鑒定與目標蛋白質相互作用的其他蛋白質，從而洞察蛋白質復合物的組成和功能。
● DNA甲基化分析：將CUT&Tag方法與DNA甲基化分析技術聯用，可以研究DNA結合蛋白與DNA甲基化之間的相互關系。通過CUT&Tag分析獲得的DNA結合蛋白的結合位點信息，結合DNA甲基化特異性的測序技術（如BS-seq或MeDIP-seq），可以探索DNA甲基化與蛋白質結合的調控機制以及其在表觀遺傳學中的作用。
● 轉錄因子蛋白-蛋白相互作用分析：CUT&Tag方法與蛋白質-蛋白質相互作用分析技術（如蛋白質質譜和免疫共沉淀）聯用，可以研究轉錄因子蛋白與其他蛋白質之間的相互作用。通過分析蛋白質復合物的組成和動態變化，可以揭示轉錄因子蛋白在基因調控網絡中的作用和調控機制。
這些聯用技術可以提供更全面和深入的信息，幫助研究人員更好地理解DNA結合蛋白與染色質相互作用的復雜性。同時，結合不同的技術還可以驗證和互相印證研究結果。
3、CUT&Tag方法的應用
● 基因調控研究：CUT&Tag方法可以揭示DNA結合蛋白在基因調控中的作用。通過識別DNA結合蛋白的結合位點和鑒定靶基因，可以了解特定轉錄因子蛋白的調控網絡，從而深入研究基因的表達調控機制。
● 表觀遺傳學研究：CUT&Tag方法可以用于研究DNA結合蛋白與染色質上的表觀遺傳修飾（如DNA甲基化和組蛋白修飾）之間的相互作用。通過與DNA甲基化分析或組蛋白修飾分析的聯用，可以揭示表觀遺傳修飾與DNA結合蛋白的協同調控作用，進一步了解表觀遺傳學調控對基因表達和細胞命運的影響。
● 染色質結構研究：CUT&Tag方法與染色質構象捕獲（Hi-C）技術結合，可以探索染色質的三維結構。通過識別DNA結合蛋白的結合位點和染色質相互作用的區域，可以重建染色質的亞結構和互作網絡，研究染色質的空間組織和基因調控機制。
● 細胞類型和發育過程的研究：CUT&Tag方法可以用于研究不同細胞類型和發育階段的基因調控差異。通過分析DNA結合蛋白的結合位點和靶基因的表達模式，可以揭示不同細胞類型之間的轉錄因子調控網絡差異和發育過程中的基因調控動態。
● 疾病研究：CUT&Tag方法在疾病研究中也有重要應用。通過比較疾病樣本與正常樣本中DNA結合蛋白的結合位點和基因表達的變化，可以鑒定與疾病相關的調控元件和靶基因，深入了解疾病的發生機制和治療靶點。
總的來說，CUT&Tag方法在基因調控、表觀遺傳學和染色質三維結構等領域的應用非常廣泛。它提供了高空間分辨率的DNA結合蛋白結合位點信息，幫助研究人員深入理解基因調控、表觀遺傳學和染色質組織等重要生物學過程。通過CUT&Tag方法，研究人員能夠揭示基因調控網絡、表觀遺傳修飾與DNA結合蛋白的相互作用以及染色質的三維結構。這些研究對于理解細胞發育、疾病發生機制以及開發新的治療策略具有重要意義。
