常見問題
將microRNA裝載到外泌體當中，可以考慮孵育，超聲，擠壓法，凍融法，或者化學轉染的方法。這些方法可以使藥物很容易進入外泌體的內部。在藥物擴散后，外泌體的膜會重新恢復。 孵育法操作相對簡單，不會破壞外泌體膜的完整性，適用于裝載疏水性小分子。電穿孔主要適用于裝載親水分子，裝載效率較高。但是可能破壞外泌體膜的穩定性。如果考慮成本還有裝載效率可以選用孵育的方法，除此之外，還有以下方法可以用來裝載microRNA. 1、超聲方法，在超聲過程中，利用超聲和勻漿探針使膜變形，從而允許藥物擴散到外泌體 2、擠壓法，將外泌體和藥物混合后通過一個只有100-400nm孔的膜，利用脂質擠壓機將藥物轉入外泌體中。 3、凍融法，將外泌體-藥物混合物在?80?C或在液氮中反復冷凍幾個循環，然后再解凍到室溫，以確保藥物的成功結合。 4、化學轉染，外泌體和藥物與表面活性劑孵育，導致膜上形成孔，從而滲透藥物。最常用的表面活性劑是皂苷，因此這種方法也稱為皂苷輔助負載法。
外泌體是內吞起源的細胞外納米膜狀囊泡，體液中循環的外泌體可以通過攜帶多種功能分子如lncRNA、miRNA、蛋白質等與受體細胞相互作用，介導細胞間通訊，從而影響腫瘤的發生發展。外泌體中檢測到的lncRNA稱為外泌體源性lncRNA。研究發現外泌體可通過向組織細胞轉移腫瘤相關lncRNA，影響腫瘤的生物學進程，在腫瘤增殖、轉移、侵襲、腫瘤耐藥、腫瘤免疫調節及新生血管形成中發揮重要作用。此外腫瘤來源的外泌體具有轉移前微環境的能力，在遠處或特定部位轉移lncRNA到受體細胞可以產生適合腫瘤細胞生長的轉移前微環境。所以腫瘤組織的微環境改變，可能導致腫瘤組織中的的lncRNA含量也會產生變化。
白是膜蛋白，所以不能煮沸嗎，其他的marker如HSP70，TSG101都跑出來了，想問一下有這回事嗎？ 膜蛋白不宜進行煮沸，一般進行煮樣后跑出來的條帶很雜，不能被抗體很好識別，可能是因為有些抗體識別的是空間結構，而不是一維線性結構。
流式細胞儀檢可以測外泌體的標志性蛋白，具體步驟如下： (1)處理樣本，提取外泌體； (2)抗體孵育：將提取的外泌體用含2％bsa的pbs溶液溶解，先后進行一抗和二抗孵育，得到cd63標記的外泌體檢測液； (3)設置流式細胞儀的參數：正常運行流式細胞儀，進行參數設置； (4)上機檢測：將所述cd63標記的外泌體檢測液加入pbs溶液重懸，上機檢測； (5)利用流式細胞儀分析軟件對數據進行分析，得到外泌體的定量檢測結果。
對于大多數涉及到Exosome RNA分離的研究，我們推薦使用血漿。血清是血液凝固之后收集的液體，所以其中少了纖維蛋白原，凝血因子，以及多了很多凝血產物。纖維蛋白原可轉化為纖維蛋白，具有凝血功能。在因為血清收集后在凝血過程中，血小板受到刺激會產生許多外泌體和其他形式的小泡，因此血清中獲得的小泡始終比血漿中多，甚至超過50%的小泡來源于血小板。所以血漿是研究病理生理狀態下外泌體更好的介質。因此一般實驗選擇血漿，但是，在研究與血小板相關的疾病的時候，應優先選擇血清。 采血過程中，我們應及時離心除去細胞和血小板，一般在30min內完成，避免長時間存放，同時，需要在室溫條件下分離血漿（或者血清），所有樣品離心時使用的轉速和轉子類型要保持一致。
理論上來說提取組織中的RNA，是會把外泌體中的RNA也提出來，但是組織中提取的RNA的量還有種類肯定是多于外泌體的。因為外泌體相對于組織來說只是很小的一部分，包含的物質也不是等同的。
利用NTA可以用于顆粒計數，但是，以顆粒數來定量外泌體，通常都會高估，因為外泌體樣本中會存在脂蛋白、蛋白團聚等，這些雜質也會被一起計入。
在電鏡拍攝的結果中外泌體的形態應該是那種明顯的茶托狀或杯狀結構，一般，在外泌體邊緣處有一圈略微更明亮的亮圈。如果在電鏡結果中看到了無膜結構，有可能不是外泌體，有可能是觀察到了脂蛋白顆粒或者蛋白質。
最常用的是CD63、CD81等
選用的這些蛋白標志物其實最初是通過純化細胞外囊泡然后通過質樸分析發現存在于細胞外囊泡的一些高豐度蛋白。 因此也就逐漸開始將他們作為細胞外囊泡標志物。其實CD63、CD9、CD81三個蛋白都是四次跨膜蛋白家族的成員。他們直接參與了細胞外囊泡內容物的分選。TSG101是ESCRT復合體相關的蛋白，ALX直接涉及到了膜泡在形成過程中切割脫離質膜形成獨立膜結構的過程。這些標志性蛋白并不是外泌體獨有的，只是因為它們主要涉及到了囊泡的形成和分泌過程，多數是膜蛋白或者是ESCRT復合體成員及相關蛋白，他們產生于細胞，定位于細胞內的膜結構附近，因此細胞中也會存在。只是因為細胞外囊泡的形成依賴于這些分子，因此這些分子在囊泡中發揮功能，因此在囊泡豐度要明顯比細胞中更高一些。
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在外泌體當中，含有大量疾病相關的多種RNA分子，如miRNA，mRNA，lncRNA等，而外泌體中RNA含量的高低主要是通過熒光定量PCR來鑒定。但是如果出現檢測內參不齊，就會限制RNA分子定量檢測的標準，而引入外參在外泌體RNA定量分析中是另外一種可選的有效手段。外參法主要是在檢測過程中，加入到待檢測樣本中的外源性物質，加入的外源性物質可以很精確的反映不同樣本在檢測過程中出現的偏差。所以若是出現內參不齊時，可以考慮引入外參。
ELISA可以用來檢測樣本中特定蛋白或細胞因子含量，同樣也是可以用來檢測外泌體中一些標志性蛋白。ELISA試劑盒檢測的樣本是有多種類型的，如血清、血漿、尿液、細胞培養上清或組織勻漿液等，對于不同的樣本，前期的處理方式也是不同的， 對于ELISA實驗的來說，實驗樣本的處理非常關鍵。在處理過程中，使提取溶劑與容器內的樣品充分接觸以深入到樣本組織內部，提取待測成分。在凈化過程中加入的溶劑，可能會降低待測組分的濃度或者不適宜直接分析，需要去除全部有機溶劑。同時要對盡量去除待測樣本中的雜質，以防干擾實驗結果。
正常情況下，血清中外泌體的含量還是很高的。一般常規實驗血清純化外泌體，建議可以先對外泌體進行鑒定，通過電鏡檢測觀察一下外泌體的是否具有杯狀結構，然后通過NTA檢測一下粒徑大小和粒徑濃度，確定沒問題進行再進行WB驗證。 WB實驗失敗的一些原因：（1）抗體染色不充分，可以增加抗體濃度，延長孵育時間進行改善。（2）檢查酶是否失活，可以直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物。（3）可以增加陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有，則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可以增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。（4）檢查抗體是否失效，看抗體是否過期，工作液盡量現配現用。
目前外泌體蛋白提取的方法相對較少，有的可以通過購買試劑盒來購買提取外泌體蛋白。在一篇專利中提到如何提取血清中的外泌體，專利申請號：CN201810287204.6 專利名稱：提取外泌體及外泌體蛋白的方法 提取外泌體方法步驟：所得含有外泌體的材料(即洗滌后的沉淀)置于冰上，向其中加入18μL4g/100mL的SDS水溶液，然后超聲(超聲條件在100W下進行)裂解20分鐘，得到超聲產物；將超聲產物在16000g下離心5分鐘，收集全部上清液；向上清液中加入82μL 8M尿素水溶液和二硫蘇糖醇，得到裂解液，該裂解液中二硫蘇糖醇的濃度為20mmol/L；將該裂解液在37℃孵育4小時，得到裂解產物；將裂解產物轉移至FASP管中，用8M尿素水溶液洗滌(FASP管是一種按分子量截留的管，洗滌過程都是通過離心完成，離心條件為14000g離心10分鐘，離心以后，絕大部分溶液和小分子物質被離心至下層接收管子里，外泌體被截留在上層的FASP管中)2次；然后加入碘乙酰胺(終濃度50mmol/L)，室溫下避光反應1小時，用50mM碳酸氫銨水溶液洗滌3次，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小時，將所得溶液45℃熱干，用0.1％(v/v)甲酸水溶液定容，得到外泌體蛋白提取液，將外泌體蛋白提取液上樣進行LC-MS/MS分析，上樣量為1μg。所得含有外泌體的材料(即洗滌后的沉淀)置于冰上，向其中加入18μL4g/100mL的SDS水溶液，然后超聲(超聲條件在100W下進行)裂解20分鐘，得到超聲產物；將超聲產物在16000g下離心5分鐘，收集全部上清液；向上清液中加入82μL 8M尿素水溶液和二硫蘇糖醇，得到裂解液，該裂解液中二硫蘇糖醇的濃度為20mmol/L；將該裂解液在37℃孵育4小時，得到裂解產物；將裂解產物轉移至FASP管中，用8M尿素水溶液洗滌(FASP管是一種按分子量截留的管，洗滌過程都是通過離心完成，離心條件為14000g離心10分鐘，離心以后，絕大部分溶液和小分子物質被離心至下層接收管子里，外泌體被截留在上層的FASP管中)2次；然后加入碘乙酰胺(終濃度50mmol/L)，室溫下避光反應1小時，用50mM碳酸氫銨水溶液洗滌3次，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小時，將所得溶液45℃熱干，用0.1％(v/v)甲酸水溶液定容，得到外泌體蛋白提取液，將外泌體蛋白提取液上樣進行LC-MS/MS分析，上樣量為1μg。
超速離心法是最常用的外泌體純化手段，采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。本實驗室通過超速離心法提取植物外泌體，有的外泌體粒徑大小在200nm左右，提取的濃度在正常范圍內。一般在樣本前處理步驟最后一步經0.22微米濾膜過濾，除去較大的囊泡，再進行超離即可。或者可以選用試劑盒或者尺寸排阻方法提取外泌體。
1. 超速離心法是最常用的外泌體純化手段，也是普遍認可的一種方式，采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。 優點：無需特殊試劑，操作簡便，適合大批量樣本。 缺點：耗時耗力，純度相對較低，回收率不穩定，重復離心會一定程度損傷外泌體，設備要求高。 2. 抗體親和（磁珠）法利用包被單克隆抗體的磁珠結合外泌體，外泌體表面有其特異性標記物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結合，即可將外泌體吸附并分離出來。 優點：純度較高，特異性和重復性好、操作簡便、無設備限制。 缺點：效率和回收率較低，僅能捕獲表達特定抗原的目標外泌體，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，囊泡完整性影響較大。 3. 微流控指的是使用微管道（尺寸為數微米到數百微米）處理或操縱微小流體（體積為納升到阿升）的系統所涉及的科學和技術。這種方法具有分離生物顆粒速度快，純度高，節省樣本，集成度高等優點。因此，雖然微流控技術在外泌體分離方面的應用仍處于起步階段，卻已經成為了當前研究的熱點。目前，近些年，基于微流控的外泌體分離技術也在不斷出現。 4. 尺寸排阻色譜(SEC)是基于尺寸而非分子量分離大分子，尺寸排阻色譜可以精確地分離大分子和小分子。SEC主要用于分離血液和尿液中的外泌體，不過，這種外泌體提取方法需要很長時間，并且不適合處理大量樣品。
外泌體鑒定可以通過電鏡、粒徑以及WB來進行，生物標志物可以選擇CD63、CD9、CD81 以及TSG101、HSP70、ALIX，一般通過WB的方式驗證外泌體是否含有一些標志性蛋白。
推薦使用華美公司的外泌體提取試劑盒來提取尿液中的外泌體，它能快速提取高質量高純度的外泌體。目前主流的提取外泌體的方法都各有利弊：使用尺寸排阻色譜(SEC)是基于尺寸而非分子量分離大分子，尺寸排阻色譜可以精確地分離大分子和小分子。SEC主要用于分離血液和尿液中的外泌體，不過，這種外泌體提取方法需要很長時間，并且不適合處理大量樣品。使用超速離心可以一次性獲得較多外泌體，但是純度不足；密度梯度離心法分離到的外泌體純度高，但是前期準備工作繁雜、耗時、量少； 抗體親和（磁珠）法：純度較高，特異性和重復性好、操作簡便、無設備限制。缺點：效率和回收率較低，僅能捕獲表達特定抗原的目標外泌體，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，囊泡完整性影響較大。
細胞培養液的量建議選擇在合適的范圍，但是目前尚未發現，培養液的量過多會影響外泌體的濃度。
