蛋白和蛋白相互作用怎么驗證?
信息來源：金開瑞 作者：genecreate_cn 發布時間：2026-01-19 13:30:18
驗證蛋白-蛋白相互作用（PPI）的方法可分為體外驗證、細胞內驗證和體內驗證三大類，不同方法的驗證維度、特異性、靈敏度不同，適配的研究場景（如初步篩選、精準驗證、生理條件下的互作確認）也有差異，實驗中常組合多種方法交叉驗證，確保互作的真實性和可靠性。以下按從簡單到復雜、從體外到體內的邏輯梳理核心方法，說明其原理、應用場景和優缺點，兼顧基礎實驗和進階研究需求：
一、體外驗證方法：直接檢測蛋白間的物理相互作用，排除細胞內其他因子干擾
這類方法使用純化的重組蛋白或體外表達的蛋白進行實驗，核心驗證“兩個蛋白是否能直接結合”，是PPI驗證的基礎初篩手段，適合快速確認互作的直接性。
1、GST pull-down（谷胱甘肽S-轉移酶下拉實驗）
原理：將其中一個蛋白與GST融合表達（誘餌蛋白），結合在谷胱甘肽瓊脂糖珠上，與另一個目標蛋白（獵物蛋白）的純化液/細胞裂解液孵育，若二者結合，獵物蛋白會隨誘餌蛋白一起被“下拉”，通過WB檢測珠上的獵物蛋白即可驗證互作。
場景：初步驗證兩個蛋白是否存在直接物理相互作用，也可篩選細胞裂解液中與誘餌蛋白結合的未知互作蛋白。
特點：操作簡單、成本低；可檢測瞬時/弱相互作用（可通過優化孵育條件增強）；但無法反映細胞內的真實互作環境。
2、Co-IP（體外共免疫沉淀，非細胞內）
原理：與細胞內Co-IP類似，但使用純化的重組蛋白進行孵育，通過針對其中一個蛋白的特異性抗體捕獲蛋白復合物，WB檢測另一個蛋白的存在。
場景：驗證純化蛋白間的直接結合，排除細胞內其他蛋白的介導作用。
特點：特異性高于GSTpull-down（依賴抗體特異性）；僅適用于已知候選蛋白的互作驗證。
3、SPR（表面等離子體共振）
原理：將一個蛋白固定在芯片表面，另一個蛋白通過溶液流經芯片，若二者結合，會改變芯片表面的等離子體共振信號，可實時定量檢測結合動力學參數（結合常數Ka、解離常數Kd、親和力KD）。
場景：精準驗證直接互作并定量分析結合能力，適合研究互作的強弱、藥物對PPI的調控作用。
特點：無標記、高靈敏度、可定量；但儀器昂貴，需高質量的純化蛋白。
4、EMSA（電泳遷移率變動實驗）
原理：若互作蛋白為核酸結合蛋白+伴侶蛋白（如轉錄因子+共激活因子），二者結合后會形成分子量更大的復合物，在非變性電泳中遷移速率慢于單個蛋白，出現條帶偏移。
場景：驗證與核酸結合相關的蛋白互作，同時可反映互作對蛋白-核酸結合的影響。
特點：可直觀看到復合物形成；但適用范圍窄，僅針對核酸相關PPI。
二、細胞內驗證方法：檢測活細胞/細胞裂解液中內源性/外源性蛋白的互作，貼近生理條件
這類方法在培養的細胞系中進行，可使用外源性過表達蛋白或檢測內源性蛋白，核心驗證“兩個蛋白在細胞內是否能形成復合物”，部分方法可定位互作發生的亞細胞區域，是PPI驗證的核心手段。
1、Co-IP（細胞內共免疫沉淀）
原理：利用細胞裂解液中的天然蛋白復合物，通過針對其中一個蛋白的特異性抗體（內參/標簽抗體）將復合物沉淀下來，WB檢測復合物中另一個目標蛋白的存在，證明二者在細胞內結合。
場景：驗證細胞內內源性/外源性蛋白的互作，是PPI驗證的金標準方法之一。
特點：貼近細胞生理環境，能檢測生理狀態下的互作；但僅能檢測穩定的蛋白復合物，瞬時/弱互作易漏檢；需保證抗體的特異性（避免非特異性結合）。
2、IF/ICC（免疫熒光/免疫細胞化學）
原理：用兩種不同熒光標記的抗體分別標記兩個目標蛋白，通過激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號的共定位情況，若二者在細胞內的同一亞細胞區域（如細胞核、細胞質、細胞膜）重疊，提示存在互作的空間基礎，結合Co-IP可確認互作。
場景：驗證蛋白互作的亞細胞定位，補充Co-IP的結果（證明互作發生的位置）。
特點：直觀、可定位；但共定位≠直接結合，需與其他方法聯合驗證；無法區分直接/間接互作。
3、BiFC（雙分子熒光互補）
原理：將熒光蛋白（如YFP、GFP）拆分為兩個無熒光的N端和C端結構，分別與兩個目標蛋白融合表達，若兩個目標蛋白在細胞內結合，會帶動熒光蛋白的兩個片段靠近并重構為有活性的熒光蛋白，在活細胞中直接觀察到熒光信號。
場景：驗證活細胞內的蛋白互作，并精準定位互作發生的亞細胞區域；可檢測瞬時/弱互作。
特點：活細胞檢測、實時可視化、高靈敏度；但外源性融合蛋白可能影響蛋白的天然構象，存在假陽性；無法定量結合能力。
4、Luciferase Complementation Assay（熒光素酶互補實驗）
原理：與BiFC類似，將螢火蟲熒光素酶拆分為N端和C端，分別與兩個目標蛋白融合表達，若二者結合，熒光素酶的兩個片段重構為有活性的酶，催化底物產生熒光，可定量檢測熒光信號強度反映互作強弱。
場景：活細胞內定量驗證PPI，也可用于高通量篩選（如篩選調控PPI的藥物、突變體）。
特點：活細胞檢測、可定量、靈敏度高；適配高通量實驗；但同樣存在外源性蛋白的構象干擾問題。
5、FRET（熒光共振能量轉移）
原理：將兩個目標蛋白分別與供體熒光蛋白和受體熒光蛋白融合，若二者在細胞內的距離小于10nm（直接結合的距離），供體熒光被激發后會將能量轉移給受體熒光，檢測到受體熒光信號即可證明直接互作。
場景：驗證活細胞內的直接蛋白互作，可實時檢測互作的動態變化（如藥物處理后的互作解離）。
特點：高特異性（僅檢測近距離直接互作）、活細胞實時檢測；但儀器要求高，實驗條件優化難度大。
三、體內驗證方法：檢測整體動物模型中蛋白的互作，反映生理/病理條件下的真實互作
這類方法在模式生物（如小鼠、果蠅、斑馬魚）中進行，核心驗證“兩個蛋白在生物體內的生理/病理狀態下是否存在功能性互作”，是PPI驗證的最終確證手段，適配后續的功能研究。
1、Co-IP（組織樣本共免疫沉淀）
原理：與細胞內Co-IP一致，只是將實驗材料替換為模式生物的組織樣本裂解液，檢測內源性蛋白在體內組織中的復合物形成。
場景：確證蛋白在體內生理條件下的真實互作，是連接細胞實驗和體內功能的關鍵。
特點：最貼近體內真實環境；但組織樣本中蛋白豐度低，需優化提取和沉淀條件。
2、Co-IP結合基因編輯動物模型
原理：通過CRISPR/Cas9構建蛋白敲除/點突變動物模型，若突變某蛋白的互作結構域后，另一個蛋白的結合能力消失，且伴隨相應的表型變化，可證明該互作具有體內功能性意義。
場景：驗證PPI的體內功能相關性，明確互作對生物表型的影響。
特點：直接關聯互作與生理功能；但實驗周期長、成本高。
3、熒光素酶互補成像（In Vivo Luciferase Complementation）
原理：將融合了熒光素酶片段的兩個目標蛋白通過轉基因/病毒注射導入動物體內，若二者在體內結合，重構的熒光素酶會催化底物產生熒光，通過活體成像儀在體觀察熒光信號，證明體內互作。
場景：在體實時觀察蛋白互作的時空分布（如不同組織、不同發育階段的互作）。
特點：體內可視化、無侵入性；但靈敏度較低，需高表達融合蛋白。
四、高通量篩選互作蛋白的方法：適合從全基因組/蛋白組水平篩選未知互作蛋白
若僅知道一個誘餌蛋白，想篩選其潛在的未知互作蛋白，可使用以下高通量方法，后續需通過上述驗證方法確認具體的PPI：
1、酵母雙雜交（Y2H）
原理：將誘餌蛋白與GAL4的DNA結合域融合，獵物蛋白與GAL4的激活域融合，若二者在酵母細胞核內結合，會重構GAL4的轉錄激活功能，驅動報告基因（如His3、LacZ）的表達，通過酵母生長/顯色篩選陽性克隆。
場景：全基因組水平篩選與誘餌蛋白互作的未知蛋白，適合PPI的初步高通量篩選。
特點：高通量、成本低；但假陽性率高（酵母內的異源表達易導致非特異性結合）；僅能檢測細胞核內的互作（經典Y2H），后續需改造系統（如膜酵母雙雜交）適配膜蛋白互作。
2、免疫共沉淀結合質譜（Co-IP-MS）
原理：用特異性抗體沉淀細胞/組織中的內源性蛋白復合物，通過質譜技術鑒定復合物中的所有蛋白，篩選出與誘餌蛋白結合的候選互作蛋白。
場景：篩選生理條件下與誘餌蛋白結合的未知互作蛋白，鑒定PPI網絡。
特點：貼近生理環境、假陽性率低；可篩選全蛋白組水平的互作蛋白；但質譜儀器昂貴，需后續的單靶點驗證。
五、PPI驗證的核心實驗原則：交叉驗證，排除假陽性
單一方法的驗證結果存在局限性（如假陽性、無法區分直接/間接互作），實驗中需遵循“體外+細胞內”“定性+定量”的交叉驗證原則，例如：
1、初步篩選：GST pull-down（體外直接）+酵母雙雜交（高通量）；
2、細胞內驗證：Co-IP（確認復合物形成）+IF（驗證共定位）+BiFC（活細胞驗證）；
3、精準定量：SPR（體外結合動力學）+熒光素酶互補（細胞內定量）；
4、體內確證：組織樣本Co-IP（體內生理互作）+基因編輯動物模型（功能相關性）。
同時，需設置嚴格的陰性對照（如空載體、突變體對照：突變蛋白的互作結構域，驗證互作的特異性），排除非特異性結合、抗體交叉反應、融合蛋白構象干擾等導致的假陽性。
六、不同研究場景的方法選擇建議
1、已知兩個候選蛋白，驗證是否直接互作：GST pull-down+Co-IP+SPR；
2、已知誘餌蛋白，篩選未知互作蛋白：酵母雙雜交+Co-IP-MS；
3、研究PPI的亞細胞定位：IF+BiFC+FRET；
4、研究藥物對PPI的調控作用：SPR（體外定量）+熒光素酶互補（細胞內高通量篩選）；
5、驗證PPI的體內生理功能：組織Co-IP+基因編輯動物模型。
最新動態
-
01.29
PKH-26染色適用于小動物活體成像嗎？在干細胞或者其他細胞的標記并使用活體成像可以嗎？
-
01.28
染色質免疫共沉淀測序(chip-seq)實驗的應用
-
01.28
染色質免疫共沉淀定量PCR(ChIP-qPCR)檢測服務
-
01.28
表觀遺傳測序ATAC-seq的開放位點百分比圖中，不同樣本的開放位點百分比差異，能否直接代表樣本間染色質表觀遺傳狀態的差異，還需結合哪些ATAC-seq下游分析結果佐證？
-
01.27
基因測序服務的核心檢測流程包含哪些環節，從樣本采集到最終報告的整體周期大概是多久？
-
01.27
定點突變服務技術的操作過程
-
01.27
單抗定制優化傳統鼠單抗制備的流程是什么？
-
01.27
表面等離子共振技術實驗步驟
-
01.27
ELISA試劑盒定制的工藝流程
-
01.26
dapseq鑒定轉錄因子結合位點的新技術
X 
