熒光素酶蛋白互補實驗（LCA）
- 高靈敏
- 低背景
- 實時監測
- 非侵入性
服務特色
與其它蛋白質互作研究技術相比, 借助于煙草瞬時表達系統的熒光素酶蛋白互補實驗(LCA)具有簡單、靈敏、可靠、高效和低背景等優點, 并可輕松擴展為大規模蛋白質互作的篩選和驗證研究。
服務介紹
熒光素酶蛋白互補實驗（Luciferase Complementation Assay，LCA）用于判斷兩個蛋白是否能夠互作，將熒光素酶蛋白的兩個片段分別連接到兩個不同的待測蛋白上，若兩個蛋白能夠結合，則熒光素酶蛋白得以補全酶解底物發出熒光。
服務優勢
- 高靈敏度：LCA能夠檢測低至皮摩爾級別的蛋白質互作，這使得它非常適合于研究低豐度蛋白質的相互作用。
- 實時監測：由于熒光素酶催化反應迅速，且生物發光信號強，LCA能夠實現實時監測蛋白質互作，無需固定或裂解細胞，從而減少了樣品處理過程中的損失和變異。
- 非侵入性檢測：LCA在活細胞內進行，不會破壞細胞結構，允許在生理條件下觀察蛋白質互作，提供更真實的生物學環境下的互作信息。
- 動態范圍寬：LCA能夠覆蓋廣泛的互作強度，從弱到強的互作均可檢測。
客戶提供
由我司基因合成：
提供蛋白CDS序列即可。
客戶提供模板質粒：
1、客戶提供載體/模板：需要提供載體mcs測序報告/模板測序結果，如無測序報告則需另外收取測序費用，由金開瑞代為測序；
2、客戶提供菌液：菌液量應≥0.5mL，放置一年以上的甘油菌需活化后送樣；
3、客戶提供質粒：質粒量≥5ug；
4、菌液和液態質粒均需冰袋運輸。
最終交付
- 返還目的基因剩余質粒；
- 默認做3個陰性對照，1個實驗組；
- 交付3片葉子照片；
- 結題報告以及全部原始數據。
服務說明
| 服務名稱 |
服務內容 |
交付內容及標準 | 服務周期（工作日） |
| 熒光素酶蛋白互補實驗(LCA) |
質粒提取 |
返還目的基因剩余質粒 | 20 |
|
注射煙草 |
默認做3個陰性對照，1個實驗組 | ||
|
拍攝照片 |
交付3片葉子照片 |
案例展示
常見問題與解析 (Q&A)
A：確保熒光素酶的兩個片段正確地融合到待測蛋白質上，且表達載體沒有構建錯誤；提高細胞或生物體的轉染或轉化效率；增加細胞數量或生物材料量；確認底物新鮮且濃度適當。
A：減少非特異性結合，比如調整洗滌條件或使用適當的封閉試劑；確保細胞健康，避免細胞裂解導致的內源性熒光素酶泄露；設立沒有預期互作的對照組，以確定背景水平。
A：標準化實驗操作，確保每次實驗的條件一致；引入內參控制，如β-半乳糖苷酶或GFP，用于標準化熒光素酶活性；多次重復實驗，以統計學方法評估數據的一致性和可靠性。
A：通過Western Blotting等方法確認蛋白質的表達水平；確保實驗條件適合蛋白質互作；考慮使用不同的蛋白質片段或突變體。
相關技術服務
| ? 雙熒光素酶報告系統 | ? 酵母雙雜交 | ? 酵母單雜交 | ? CoIP |
| ? DNA pull-down | ? EMSA | ? CUT&Tag | ? 亞克隆/載體構建 |
| ? RIP-qPCR | ? ChIP-qPCR | ? RNA pulldown | ? 雙分子熒光互補（BiFC） |
| ? 植物亞細胞定位 | |||
相關資源
1、熒光素酶蛋白互補實驗為什么選擇煙草葉片作為實驗材料？
● 易于轉化與表達：煙草植物（尤其是本氏煙草，Nicotiana benthamiana）是植物分子生物學研究中常用的模式植物之一，因為它對于基因轉化具有很高的效率，特別是通過農桿菌介導的瞬時表達系統。這使得LCA所需的重組熒光素酶片段可以在煙草葉片中快速、高效地表達。
● 葉片大且平展：煙草葉片較大且表面平展，適合進行局部的注射或浸潤處理，便于進行農桿菌介導的基因轉移，同時也有利于觀察實驗結果，如生物發光信號的檢測。
● 快速的生理響應：煙草葉片在轉化后24-48小時內即可觀察到熒光素酶的活性，這反映了蛋白質的快速表達和互作，縮短了實驗周期。
● 低背景熒光：煙草葉片本身不含或含有極低水平的內源熒光素酶活性，這降低了背景信號，提高了實驗的信噪比，使得蛋白質互作的檢測更加敏感和可靠。
● 適合大規模實驗：煙草葉片的大面積和易操作性使其適合進行大規模的蛋白質互作篩選實驗，尤其是在需要比較大量樣本的情況下。
● 成熟的技術體系：由于煙草葉片在植物遺傳轉化和蛋白質表達研究中的廣泛應用，已經建立了成熟的技術體系，包括高效的基因遞送、蛋白質表達和檢測方法，這為LCA的實施提供了便利。
● 經濟可行性：煙草植物易于培養和維護，與動物細胞相比，其成本較低，適合長期和大規模的研究項目
2、熒光素酶蛋白互補實驗在多個研究領域中展現出廣泛的應用價值，主要包括哪些？
● 蛋白質互作研究：LCA能實時監測活細胞內蛋白質間的直接或間接相互作用，為理解細胞信號傳導、復合體組裝及蛋白質網絡提供數據。
● 植物科學：LCA在植物激素響應、抗逆境信號轉導等領域有所應用，促進作物改良和農業生產。
● 藥物發現與篩選：通過檢測特定蛋白質互作的變化，LCA可應用于高通量藥物篩選，加速新藥開發過程。
● 信號轉導分析：LCA幫助揭示信號蛋白如何在細胞內相互作用并傳遞信號，深入探究信號轉導通路的分子機制。
● 病原體-宿主互作：LCA在解析病原體感染機制、宿主防御反應及免疫應答中發揮作用，增進對感染性疾病的理解。
● 遺傳疾病機制：通過研究疾病相關蛋白質的異常互作，LCA助力遺傳疾病的發生和發展機理研究。
● 腫瘤學：該技術用于研究腫瘤發生、發展過程中的蛋白質互作網絡，為癌癥治療提供理論基礎。
3、熒光素酶蛋白互補實驗通常與其他實驗技術聯用，以增強實驗的準確性和全面性，或者從不同角度驗證和補充實驗結果。
以下是一些常見的與LCA聯用的實驗技術：
● 免疫共沉淀（Co-IP）：Co-IP是一種經典的蛋白質互作檢測方法，通過抗體特異性地富集目標蛋白及其結合伙伴，隨后通過SDS-PAGE和Western Blotting進行分析。與LCA聯用可以驗證蛋白質互作的真實性，并提供互作蛋白的直接證據。
● 熒光共振能量轉移（FRET）：FRET技術通過檢測兩個熒光基團之間的能量轉移來監測蛋白質間的近距離相互作用。與LCA結合使用可以提供互作蛋白間距離的信息，進一步確認蛋白質復合體的結構特征。
● 質譜分析（MS）：在LCA檢測到蛋白質互作后，通過質譜分析可以鑒定出互作蛋白的具體種類，提供蛋白質組學層面的信息，有助于構建詳細的蛋白質互作網絡。
● 酵母雙雜交（Y2H）：Y2H是一種在酵母細胞內檢測蛋白質互作的方法，特別適合于大規模篩選未知互作蛋白。與LCA聯用可以相互驗證，特別是在高通量篩選后的驗證階段。
● 細胞圖像分析：通過熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察細胞內蛋白質定位和分布，與LCA聯用可以提供蛋白質互作的空間信息，了解蛋白質復合體的亞細胞定位。
● 基因沉默技術（siRNA/shRNA/Crispr-Cas9）：通過基因沉默技術降低特定蛋白質的表達水平，可以研究該蛋白在蛋白質互作網絡中的作用，與LCA結合使用可以進一步探討蛋白質互作的功能意義。
● ChIP-seq：針對轉錄因子的研究，Chromatin Immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) 可以確定轉錄因子在全基因組范圍內的結合位點，與LCA聯用可以深入理解轉錄因子復合體的構成和作用機制。
