實(shí)驗(yàn)原理
免疫共沉淀(Co-lmmunoprecipitation)是利用抗原與抗體之間的專一性作用為基礎(chǔ),從而用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的一種方法。抗體與裂解液中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后,再與ProteinA/G偶聯(lián)的Sepharose或MagneticBeads孵育,通過(guò)離心或者借助磁力架獲得ProteinA/G磁珠-抗體-目的蛋白復(fù)合物,在高溫及還原劑的作用下,抗原與抗體解離,收集上清,上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白,再通過(guò)Western Blot或質(zhì)譜(MS)鑒定蛋白質(zhì)。其原理圖如下:
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
• 精準(zhǔn)捕獲：對(duì)磁珠和緩沖液進(jìn)行優(yōu)化升級(jí)，確保靶蛋白及其互作蛋白的高效富集，降低非特異性結(jié)合。
• 低背景設(shè)計(jì)：優(yōu)化洗脫液和洗滌方案減少干擾信號(hào)，提升弱相互作用的檢出率，適合低豐度蛋白研究。
• 標(biāo)準(zhǔn)化流程：詳細(xì)步驟說(shuō)明書（含有操作視頻鏈接），新手也能快速上手，減少優(yōu)化時(shí)間。
• 操作簡(jiǎn)便：節(jié)省時(shí)間、結(jié)果客觀準(zhǔn)確。
應(yīng)用范圍
1、蛋白質(zhì)相互作用驗(yàn)證
2、鑒定多蛋白復(fù)合物的成員（如轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、酶復(fù)合物或病毒-宿主蛋白復(fù)合物）。
3、翻譯后修飾研究：分析磷酸化、泛素化等修飾對(duì)蛋白互作的影響，常結(jié)合質(zhì)譜或特異性抗體使用
實(shí)驗(yàn)流程
試劑盒組分
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組分 |
容量（6T） | 保存溫度 |
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Lysis buffer |
9mL | 4℃ |
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ProteinA/G Magnetic Beads |
200μL | 4℃ |
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Incubation buffer |
4.5mL | 4℃ |
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Wash buffer |
20mL | 4℃ |
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Elution buffer |
700μL | 4℃避光 |
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Protease inhibitor（100X） |
35μL | -20℃ |
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Normal Rabbit IgG（1mg/mL） |
30μL | -20℃ |
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Normal Mouse IgG（1mg/mL） |
30μL | -20℃ |
特別提醒1：需?備PBS、6Xloadingbuffer、磁?架等試劑耗材。
特別提醒2：6T為6次單組（1組IP或1組IgG）免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，后?的操作步驟中包含了IgG和IP各1組，需消耗2T試劑。
常見(jiàn)問(wèn)題與解答
Q1：通過(guò)CoIP后WB驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有想要的目的條帶？
A：多方面原因造成:
1）有可能是樣品被蛋白酶降解，對(duì)應(yīng)的策略是需要添加蛋白酶抑制劑，所有操作保持4℃以下冰上操作并且避免反復(fù)凍融。
2）有可能是抗體濃度太低導(dǎo)致條帶較淺，則需要調(diào)整IP或WB抗體濃度，必要時(shí)設(shè)立濃度梯度，摸索最佳濃度。
3）抗體親和力太低，選用適合于IP或者WB的抗體。
4）有的IP抗體未與磁珠結(jié)合，這種情況需選用適合IP的磁珠。
5）若Tag未暴露在融合蛋白構(gòu)象的表明，則需改變Tag融合表達(dá)部位。
6）裂解液鹽堿度太高，需用低鹽堿度的裂解液。
7）抗體選擇不當(dāng)，更換抗體。
Q2：通過(guò)CoIP后WB驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，雖然可見(jiàn)目的條帶，但是背景很高：
A：多方面原因造成:
1）由非特異帶白結(jié)合導(dǎo)致背景高，若要避色主特異性帶白結(jié)合，則需要在無(wú)血清溶液中裂解細(xì)胞，且在免疫沉淀前用protein(A/G)磁珠預(yù)洗免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和鹽堿度(高鹽或去垢劑)。
2）實(shí)驗(yàn)儀器或試劑被污染，使用潔凈的儀器及實(shí)際。
3）轉(zhuǎn)移膜上的目特異吸附導(dǎo)致背景高，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中載手套，使用鑷子來(lái)取，不要接觸膜轉(zhuǎn)移面。
4）制備樣品中可能有不完全溶釋的大的蛋白復(fù)合體，則在制備樣品后進(jìn)行知暫超聲處理(3次，每次5秒鐘 )，然后離心，取上清后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
5）洗滌不徹底，則需要多次洗滌，并設(shè)新增加洗滌液中的NaCl和去垢劑濃度。
6）可能有非特異性蛋白吸附于珠子上，則須進(jìn)行Preclearing以排非特異性吸付。
7）抗體本身待異性不好可能導(dǎo)數(shù)者景高，則須選擇合適的抗體，可以考慮單抗。
8）使用了過(guò)多的細(xì)胞或組織進(jìn)行裂解導(dǎo)致背景高，則須減少樣本量，推薦100-500ug細(xì)胞裂解物。
9）蛋白降解也可能出現(xiàn)高背景的情況，盡量使用新鮮制備的樣品。
相關(guān)產(chǎn)品
⇒ 銀染試劑盒(Silver Stain Kit) ⇒ Co-IP試劑盒（植物）
⇒ ChIP試劑盒（動(dòng)物） ⇒ ChIP試劑盒（植物）
⇒ DNA pull-down試劑盒（動(dòng)物） ⇒ DNA pull-down試劑盒（植物）
相關(guān)技術(shù)服務(wù)
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? RIP-qPCR ? DNA pull-down ? ChIP-qPCR ? 酵母單雜交
