GST Pull-Down實(shí)驗(yàn)基于GST(glutathione-S-transferase),即谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶蛋白，可以與谷胱甘肽(Glutathione,GSH)結(jié)合,將GSH固定于磁珠上,形成GSH-磁珠,將已知蛋白X與GST融合表達(dá),獲得的GST-X蛋白可與GSH-磁珠結(jié)合，若體系中存在與X蛋白互做的蛋白Y,則會(huì)形成“磁珠-GSH-GST-X-Y”復(fù)合物,與X蛋白互做的蛋白即可被分離并檢測(cè)。

• 高特異性與可靠性：GST標(biāo)簽與谷胱甘肽磁珠的親和力強(qiáng)、結(jié)合穩(wěn)定，顯著降低非特異性結(jié)合背景。

• 試劑盒提供優(yōu)化升級(jí)的緩沖液，節(jié)省實(shí)驗(yàn)優(yōu)化時(shí)間

• 高性價(jià)比：操作迅速便捷; 成本較低，成本遠(yuǎn)低于Co-IP或酵母雙雜交等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

• 蛋白互作驗(yàn)證：直接檢測(cè)體外蛋白間結(jié)合（如激酶-底物、受體-配體、轉(zhuǎn)錄因子-DNA結(jié)合蛋白）信號(hào)通路研究或者藥物靶點(diǎn)開發(fā)。

• 病原體-宿主互作研究：鑒定病毒/細(xì)菌蛋白與宿主蛋白的相互作用

通過pull-down后WB驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),雖然可見目的條帶,但是背景很高:

多方面原因造成:

1)實(shí)驗(yàn)儀器或試劑被污染,使用潔凈的儀器及試劑。

2)轉(zhuǎn)移膜上的目特異吸附導(dǎo)致背景高,實(shí)驗(yàn)操作過程中載手套,使用鑷子來取,不要接觸膜轉(zhuǎn)移面。

3)制備樣品中可能有不完全溶釋的大的蛋白復(fù)合體,則在制備樣品后進(jìn)行知暫超聲處理(3次,每次5秒鐘),然后離心,取上清后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

4)洗滌不徹底,則需要多次洗滌,并設(shè)新增加洗滌液中的NaCl和去垢劑濃度。

5)使用了過多的細(xì)胞或組織進(jìn)行裂解導(dǎo)致背景高,則須減少樣本量,推薦100-500ug細(xì)胞裂
解物。

6) 蛋白降解也可能出現(xiàn)高背景的情況,盡量使用新鮮制備的樣品。

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