酵母核體系雙雜交技術(shù)是基于對(duì)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子特別是酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)的研究，GAL4包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activating domain,AD)。BD能夠識(shí)別位于GAL4效應(yīng)基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)并與之結(jié)合，AD可以啟動(dòng)UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD和AD分別單獨(dú)作用并不能激活轉(zhuǎn)錄，但是當(dāng)二者在空間上充分接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性并可激活UAS下游啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子下游基因并使其表達(dá)。

Y2HGold菌株是GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證。Y2HGold-GAL4酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：pGBKT7和pGADT7。質(zhì)粒pGBKT7的篩選標(biāo)志為T(mén)RP1，用于表達(dá)BD(來(lái)自酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4 N端1~174位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白;質(zhì)粒pGADT7的篩選標(biāo)志為L(zhǎng)EU，用于表達(dá)AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Prey)的融合蛋白。本試劑盒提供的產(chǎn)品包含了酵母雙雜驗(yàn)證過(guò)程中用到的各種培養(yǎng)基以及酵母轉(zhuǎn)化試劑，操作簡(jiǎn)單，能用于10對(duì)雙雜的互作驗(yàn)證(質(zhì)粒需自行擴(kuò)繁)。

1.采用多個(gè)篩選步驟，可以減少非特異性相互作用的假陽(yáng)性結(jié)果。
2.每個(gè)環(huán)節(jié)均有嚴(yán)格的質(zhì)控，實(shí)驗(yàn)效率更高。
3.可處理復(fù)雜樣本，同時(shí)篩選和鑒定多個(gè)蛋白質(zhì)間的相互作用，實(shí)現(xiàn)高通量的篩選和分析。
4.使用操作簡(jiǎn)便，更易上手。
5.性?xún)r(jià)比高:試劑配套齊全，價(jià)格優(yōu)惠，低于市面上同款產(chǎn)品。

稀釋點(diǎn)種驗(yàn)證

1：Y2H[pGBKT7-A + pGADT7 ]（自激活）

2：Y2H[pGBKT7-A + pGADT7-B ]（實(shí)驗(yàn)組）

+：Y2H[pGBKT7-53 + pGADT7-T]（陽(yáng)性對(duì)照組）

 -：Y2H[pGBKT7-lam + pGADT7-T]（陰性對(duì)照組）

Ql:酵母雜交發(fā)生假陽(yáng)性的原因及解決方式?
產(chǎn)生原因:
(1)由于BD融合誘餌蛋白有單獨(dú)激活作用，或者其激活作用被外來(lái)蛋白激活。
(2)AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結(jié)合，也可以單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。
(3)BD和AD在文庫(kù)中會(huì)有隨機(jī)碰撞導(dǎo)致空間上的接近，以致下游報(bào)告基因的表達(dá)。

解決方法:
(1)對(duì)于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證來(lái)說(shuō)，可同時(shí)將誘餌和獵物進(jìn)行自激活驗(yàn)證，減少假陽(yáng)性的判定，但是一旦誘餌和獵物均產(chǎn)生自激活，后續(xù)自激活的處理方式(截短)會(huì)浪費(fèi)較多的時(shí)間;
(2)由于每個(gè)報(bào)告基因上游的調(diào)控區(qū)各不相同，因此用不同的報(bào)告基因驗(yàn)證陽(yáng)性，可用于排除或減少假陽(yáng)性，這也是我們主要采取的方式;
(3)單雜啟動(dòng)子，我們主要采用將報(bào)告基因整合到酵母的染色體上，可以使基因表達(dá)水平穩(wěn)定，消除了由于質(zhì)粒拷貝數(shù)變化引起的基因表達(dá)水平的波動(dòng)而造成的假陽(yáng)性。

Q2:如果誘餌可以直接激活報(bào)告基因，該如何處理?
為保證誘餌蛋白功能的完整性，首先我們會(huì)考慮用3’AT/ABA進(jìn)行背景抑制，但是由于這兩種試劑對(duì)酵母生長(zhǎng)具有較大的毒性，后續(xù)可能會(huì)影響文庫(kù)篩選，因此在3'AT超過(guò)15mM，ABA超過(guò)1200ng/mL時(shí)我們會(huì)考慮將誘餌蛋白進(jìn)行截?cái)啵ㄟ^(guò)查閱文獻(xiàn)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，截去轉(zhuǎn)錄激活的區(qū)域，但是需要注意的是，截去的這一部分很有可能會(huì)影響到互作結(jié)果。

Q3:如何從驗(yàn)證結(jié)果判斷兩個(gè)蛋白是否互作及互作強(qiáng)度?
酵母核雙雜點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證是根據(jù)是否激活3個(gè)報(bào)告基因(MELI、HIS、Ade2)來(lái)反推是否有互作，是否激活了報(bào)告基因又是根據(jù)涂布相應(yīng)平板的顏色反應(yīng)及菌落有無(wú)及大小來(lái)判斷，因此我們可以直接根據(jù)顯藍(lán)的強(qiáng)弱、TDO上斑的多少以及大小、QDO上是否能生長(zhǎng)來(lái)初步判斷互作的強(qiáng)弱。

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