膜體系酵母雙雜是基于分離的泛素(split-ubiquitin)介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)，該系統(tǒng)可用于膜蛋白-膜蛋白或膜蛋白-胞質(zhì)蛋白之間的互作檢測(cè)。
泛素是一種含76個(gè)氨基酸的保守蛋白，它經(jīng)常作為降解信號(hào)連接在蛋白質(zhì)的N端。泛素能被其特異性的蛋白酶(ubiquitin-specific proteases, UBPs)識(shí)別并從所連接的蛋白上切割下來(lái)，切割位點(diǎn)總是位于泛素蛋白的C端。在酵母細(xì)胞中，泛素可以分成兩部分單獨(dú)表達(dá)，即其N端部分(NubI,第1~34位氨基酸)和C端部分(Cub,第35~76位氨基酸)，后者融合有能啟動(dòng)核內(nèi)報(bào)告基因表達(dá)的LexA-VP16蛋白。

野生型NubI和Cub具有高親和力，并且可以自發(fā)重組形成異源二聚體。但是當(dāng)野生型NubI的第13位Ile被Ala或Gly取代后，NubI和Cub就不能自發(fā)結(jié)合，因此，NubG(I13G)和Cub-LexA-VP16只有依靠bait和prey相互作用進(jìn)行連接形成完整的泛素分子，然后誘導(dǎo)UBPs識(shí)別并于其C端進(jìn)行剪切，從而釋放出轉(zhuǎn)錄因子LexA-VP16，最終啟動(dòng)核內(nèi)報(bào)告基因(HIS3、ADE2、LacZ)的轉(zhuǎn)錄。

1.采用多個(gè)篩選步驟，可以減少非特異性相互作用的假陽(yáng)性結(jié)果。
2.每個(gè)環(huán)節(jié)均有嚴(yán)格的質(zhì)控，實(shí)驗(yàn)效率更高。
3.可處理復(fù)雜樣本，同時(shí)篩選和鑒定多個(gè)蛋白質(zhì)間的相互作用，實(shí)現(xiàn)高通量的篩選和分析。
4.使用操作簡(jiǎn)便，更易上手。
5.性價(jià)比高: 試劑配套齊全，價(jià)格優(yōu)惠，低于市面上同款產(chǎn)品。

稀釋點(diǎn)種驗(yàn)證

1：pBT3-A和pPR3-N（自激活）

2：pBT3-A和pOst1-NubI（功能驗(yàn)證）

3：pBT3-A和pPR3-N-B（實(shí)驗(yàn)組）

+：pTSU2-APP和pNubG-Fe65（陽(yáng)性對(duì)照組）

-：pTSU2-APP和pPR3-N（陰性對(duì)照組）

Q1:膜體系為什么要做功能驗(yàn)證?怎樣進(jìn)行功能驗(yàn)證?
膜系統(tǒng)載體的選擇主要根據(jù)誘餌跨膜的類型進(jìn)行選擇，為驗(yàn)證誘餌載體是否構(gòu)建正確，能在細(xì)胞中形成正常的功能，需要將重組誘餌質(zhì)粒和獵物載體pOST1-NubI共轉(zhuǎn)化酵母菌株中，通過(guò)涂布缺陷型和報(bào)告基因平板，如果均生長(zhǎng)，說(shuō)明誘餌和獵物的功能域形成了完整的泛素，激活了報(bào)告基因的表達(dá)，誘餌構(gòu)建無(wú)誤，能夠形成正常的定位和功能。

Q2:用篩出的陽(yáng)性結(jié)果做點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證現(xiàn)陰性結(jié)果的原因是什么?
(1)酵母雜交本身也是存在假陽(yáng)性的情況，有可能這兩個(gè)基因根本不互作，合成全長(zhǎng)進(jìn)行驗(yàn)證自然也不會(huì)產(chǎn)生互作;
(2)對(duì)于雙雜來(lái)說(shuō)一般是兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的互作，如果互作的兩個(gè)基因的結(jié)構(gòu)域恰好處于接觸的狀態(tài)，那么就可以發(fā)生相互作用;
(3)有些互作為瞬時(shí)互作，在文庫(kù)篩選時(shí)可能捕捉導(dǎo)了互作，而在兩個(gè)基因進(jìn)行單獨(dú)驗(yàn)證時(shí)就顯示為陰性;
(4)有些互作為間接互作，可能需要依靠第三個(gè)基因的作用，促進(jìn)這兩個(gè)基因的互作;
(5)有些蛋白在正天然情況下可能為膜蛋白或者是定位在膜上的蛋白，酵母雜交雖然是模擬體內(nèi)互作，但是與天然狀態(tài)下的蛋白還是有一定的差距的，為保證兩個(gè)蛋白在同一空間，誘餌和獵物載體均帶有核定位信號(hào)，會(huì)強(qiáng)行的將他們定位在核內(nèi)，因此可能會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性的情況。

Q3:篩出的陽(yáng)性結(jié)果為什么需要重新合成全長(zhǎng)而不是片段做回轉(zhuǎn)驗(yàn)證?
(1)片段的序列是基于測(cè)序結(jié)果得出來(lái)的，可能會(huì)有突變和缺失的情況，可能不是一個(gè)完整的結(jié)構(gòu)域;
(2)將陽(yáng)性測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索時(shí)，由于為片段式可能會(huì)匹配到很多的基因，沒(méi)有辦法確定為哪一個(gè)基因，需要進(jìn)行試驗(yàn)確認(rèn)才能定位到具體的基因，在進(jìn)行后續(xù)的輔助實(shí)驗(yàn)EMSA，pulldown等實(shí)驗(yàn)時(shí)才有理論依據(jù)，否則在發(fā)文章時(shí)僅憑不能確定基因的片段并不能作為有力的支撐。

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